El Virreinato del Río de la Plata fue creado en 1776 por el rey Carlos III, integrando en su jurisdicción los actuales territorios de Argentina, Uruguay, Río Grande del Sur y Santa Catarina actual Brasil, Paraguay, Bolivia y el norte de Chile. La creación del nuevo Virreinato del Río de La Plata desligó al Paraguay del Virreinato del Perú. La capital del nuevo virreinato se hallaba en la ciudad de Buenos Aires.
En 1782, se estableció en el virreinato el régimen de las intendencias. Asunción era, en la Provincia o Intendencia del Paraguay, la única población con categoría de ciudad. La zona al sur del río Tebicuary y al este de la cordillera de Caaguazú por su parte correspondía a la Gobernación de las Misiones Guaraníes (o Provincia Subordinada de las Misiones) constituida con los restos de las Misiones Jesuíticas que pudieron quedar bajo control español.
En 1806 y 1807 se producen las Invasiones Inglesas que ocupan las zonas del Virreinato del Río de la Plata correspondientes a la Banda Oriental y a gran parte de Buenos Aires, desde Asunción y desde Córdoba se enviaron tropas que apoyaron en la victoria contra los atacantes.
En 1810 llegó a Buenos Aires la noticia de que España había sido ocupada por tropas francesas de Napoleón Bonaparte. Los patriotas argentinos prepararon el movimiento revolucionario. En Buenos Aires se reunieron en un Cabildo Abierto y establecieron la Primera Junta (25 de mayo de 1810) con el objetivo de formar un congreso de todas las provincias del Virreinato del Río de La Plata, es la Revolución de Mayo. En 1810, debido a la Primera Junta independiente de Buenos Aires, el gobernador realista de Asunción, Bernardo de Velasco remitió a Buenos Aires una nota comunicando la separación de la Provincia del Paraguay del Virreinato del Río de La Plata, Velasco y sus adeptos formaron una junta el 24 de junio de 1810, junta que reiteró su fidelidad a la monarquía española de Fernando VII.
En 1811 las tropas al mando del General Manuel Belgrano marcharon en una expedición para libertar al Paraguay, pero fueron derrotadas en la batalla de Tacuarí (9 de marzo de 1811) y en la de Paraguarí por las tropas locales, hasta entonces declaradas realistas. Las tropas vencedoras asumieron una nueva identidad y el 14 de mayo de 1811 estalló el movimiento revolucionario paraguayo, dirigido en lo militar por el capitán Pedro Juan Caballero, Fulgencio Yegros, Vicente Ignacio Iturbe y Mauricio José Troche y en lo político por Fernando de la Mora, Juana de Lara, Juan Valeriano Zeballos y José Gaspar Rodríguez de Francia, quienes intimaron al Gobernador Velasco a unírseles. Zeballos y Francia asumieron entonces un cogobierno con el funcionario español. Velasco sería destituido antes de un mes.
El 17 de junio de 1811 un congreso nombró una junta gubernativa presidida por Fulgencio Yegros. Se estableció un proyecto de confederación entre las Provincias Unidas del Río de la Plata y Paraguay (inclusive llamando a la integración de toda Latinoamérica), pero los intereses contrapuestos de las elites porteñas y asuncenas chocaron a despecho de las intenciones de los patriotas y los pueblos, tal desinteligencia fue incentivada por el Reino Unido de Portugal, Brasil y Algarve. El 12 de octubre de 1811 se firmó con el enviado de Buenos Aires, el General Manuel Belgrano, un Tratado de Amistad, Auxilio y Comercio.
El 25 de noviembre de 1842 un congreso declaró formalmente la independencia del Paraguay respecto de la Confederación Argentina, comunicándoselo a Rosas, quien la rechazó y no fue reconocida por la Argentina hasta el 17 de julio de 1852.
